Inmunología - Referencia
Procedimientos- Inmunoquímicos
Inmunonefelometría
Electroforesis de Proteina
Inmunoelectroforesis (IEF)
Inmunofijación
Actividad Funcional Sistema Complemento
Factor Reumatoídeo
Inmunofluoresencia Indirecta
Enzimainmunoanálisis (EIA)
Referencias
Inmunonefelometría
  (cuantificación de IgG, IgA, IgM, IgAsecretora, C3, C4, alfa-1 antitripsina, haptoglobina, albúmina y otras proteínas del suero, líquido céfaloraquídeo, orina y saliva total)

Introducción

La inmunonefelometría es una técnica automatizada para cuantificar proteínas del suero y otros líquidos biológicos con mayor sensibilidad y precisión que las técnicas tradicionales de inmunodifusión radial y turbidimetría.

La reacción de inmunoprecipitación producida por el complejo antígeno-anticuerpo es detectada por un haz de luz que se dispersa en un ángulo determinado entre 10 a 70 º en relación al rayo incidente. La lectura de la luz se puede realizar a punto final o en forma cinética.


Reactivos y Materiales

Tampones de dilución y de reacción, generalmente de origen comercial.
Suero estándar (calibrador) y control, trazados a un patrón internacional.
Antisueros monoespecíficos estandarizados y de alta calidad.
Nefelómetro.

Desarrollo del proceso

Seguir el procedimento indicado por el fabricante de acuerdo a la normalización, calibración y control de calidad interno del nefelómetro

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Electroforesis de Proteina
  (en lámina de agarosa)

Introducción

La electroforesis es un método que permite evaluar los componentes proteicos del suero y otros fluídos biológicos. La lectura en un densitómetro del patrón electroforético, característico de varias patologías, proporciona los valores porcentuales y absolutos de cada fracción proteica de la muestra en estudio.

La electroforesis es el movimiento de partículas o moléculas que se separan de acuerdo a su carga neta al ser sometidas a la acción de un campo eléctrico aplicado externamente. La separación electroforética depende de factores como el pH y fuerza iónica de la solución tampón, tipo de soporte, voltaje aplicado y calor generado en el proceso.


Reactivos y Materiales

Tampón Tris-barbital 0.1 M;pH 8.8
Solución de tinción azul ácido concentrado ( 0.1 % ) en ácido acético al 50 %. (antes de usar diluir1/10 con agua destilada)
Solución decolorante: ácido acético al 5 %.
Lámina de agarosa de origen comercial.

 

Desarrollo del proceso

Aplicar 2 uL de la muestra diluída 1/2, según plantilla.
Realizar la electroforesis a 110 volts por 15 minutos (este voltaje y tiempo puede ser variable de acuerdo a las condiciones del laboratorio).
Secar la lámina en un secador con aire circulante entre 60 a 70 ºC durante 5 a 10 minutos.
Teñir y decolorar el gel. Secar.
Leer las bandas electroforéticas en un densitómetro.
Informar los porcentajes relativos y los valores absolutos en g/dL de cada una de los fracciones.
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Inmunoelectroforesis (IEF)
  Introducción

La inmunoelectroforesis es una técnica cualitativa que permite la identificación de diferentes componentes proteicos a través de arcos de precipitación, que tienen movilidad electroforética semejante, pero poseen diferente peso molecular y/o diferentes determinantes antigénicos.

La inmunoelectroforesis se realiza preferentemente en geles agarosa y se distinguen dos etapas:
1) la muestra de proteínas se somete a separación electroforética y 2) terminada la electroforesis, las proteínas son precipitadas con antisueros poli o monoespecíficos, aplicados en el agar en un canal paralelo al eje de migración. Luego de un período de difusión en cámara húmeda, se observan arcos de precipitación cuya forma y posición dependen de las características inmunoquímicas y de la concentración de cada proteína.


Reactivos y Materiales

Tampón barbital-HCl 0.1 M;pH 8.6, diluído 1/2 para corrida.
Agarosa al 1 % en tampón barbital-HCl 0,1 M; pH 8.6; diluido 1/3.
Antisueros polivalentes y monoespecíficos.
Suero control: suero humano normal teñido con azul de bromofenol.
  Solución salina, cloruro de sodio al 0.9 %

Desarrollo del proceso (microtécnica de Scheidegger)

Preparar placa de agarosa, aplicar muestra y suero control según plantilla.
Realizar separación electroforética a 220 V por 60 minutos.
Aplicar antisueros monoespecíficos según plantilla. Dejar difundir 24 horas en cámara húmeda a temperatura ambiente.
Identificar y comparar los arcos de precipitación de la muestra con el suero control.
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Inmunofijación
  Introducción

La inmunofijación es una técnica cualitativa alternativa y/o complementaria de la inmunoelectroforesis que permite la identificación de componentes proteicos a través de la formación de bandas de precipitación antígeno-anticuerpo en un corto tiempo de incubación. La ventaja de esta técnica con respecto a la inmunoelectroforesis es su mayor sensibilidad y un tiempo corto de obtención de resultados (1 a 2 horas).

La inmunofijación es un proceso en dos etapas: 1) electroforesis en gel de agarosa, separación de las proteínas y 2) inmunoprecipitación, aplicación de un anticuerpo monoespecífico del antígeno de interés sobre el gel de agarosa. Por difusión pasiva se produce localmente una reacción de precipitación antígeno-anticuerpo.


Reactivos y Materiales

Tampón barbital-HCl 0.1 M;pH 8.6, diluído 1/2 para la corrida.
Solución de tinción azul ácido concentrado (0.1 %) en ácido acético al 50 %. (antes de usar diluir 1/10 con agua destilada).
Solución fijadora proteina, ácido sulfosalicilico al 10 % en ácido acético glacial al 10 %.
Antisueros monoespecíficos anti humano: anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM, anti-kappa (libre y unida), anti-lambda (libre y unida).
Solución decolorante: ácido acético al 5%.
Lámina de agarosa y plantillas comerciales.

Desarrollo del proceso

*Para "kits" comerciales seguir protocolo fabricante

En la zona de aplicación de la muestra en la lámina de agarosa colocar un trozo de papel filtro (permite eliminar exceso de líquido) por 10 segundos.
Colocar la plantilla de aplicación muestra y aplicar 3 uL de suero diluído 1/2 en el tampón tris-barbital corrida para la obtención del patrón electroforético, y diluído 1/10 para la inmunofijación. Dejar 5 minutos.
Llevar la lámina de agarosa a la cámara.
Realizar la electroforesis a 120 volts por 25 minutos (este voltaje y tiempo puede ser variable de acuerdo a las condiciones del laboratorio).
Terminada la corrida, aplicar 1 uL del control apropiado (suero normal) en los pozos del gel.
Dejar 3 minutos.
Aplicar 50 uL de solución de fijación a la corrida correspondiente y 50 uL de antisueros a las corridas para inmunofijación.
Incubar 10 minutos en la cámara de incubación a temperatura ambiente.
Retirar la plantilla y lavar brevemente con solución salina agitando suavemente.
Cubrir el gel con un set de papel filtro de secado y presionar con un peso por 5 minutos.
Lavar con solución salina por 4 minutos. Repetir paso anterior.
Secar el gel entre 60 a 70ºC con circulación de aire.
Sumergir en solución de tinción por 4 minutos
Decolorar 2 veces por 2 minutos en solución decolorante.
Lavar con agua destilada y secar entre 60 y 70ºC.
Identificación de las bandas de precipitación y comparación con las bandas presentes en el patrón electroforético. Interpretar los resultados.
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Actividad Funcional Sistema Complemento
Objetivo

La capacidad funcional del sistema complemento puede evaularse a través de la actividad hemolítica midiendo su acción lítica sobre glóbulos rojos de cordero sensibilizados con anticuerpo anti-eritrocito (hemolisina) en proporciones óptimas.

El complemento tiene un comportamiento transitorio como reactante de fase aguda y por tanto puede aumentar la actividad hemolítica por sobre los niveles normales en pacientes en etapa aguda o activa, como por ejemplo en enfermedades de las articulaciones.

La actividad hemolítica del complemento se realiza determinando la dilución de suero que lisa el 50% de eritrocitos indicadores, que han sido previamente sensibilizados en forma óptima con su anticuerpo específico (hemolisina). Se designa como actividad hemolítica 50% del complemento o CH50.


Reactivos y Materiales

Solución MgCl2 1 M - CaCl2 0.3 M (solución stock).
Tampón barbital sódico (TBS) 0.025 M;pH 7.5, NaCl 0.75 M. Tampón stock (dilución de .trabajo 1/5).
Solución anticoagulante de Alsever pH 6.1 estéril: dextrosa 20.5 g/L, citrato de sodio x 2 H2O 8.0 g/L, ácido cítrico x 1 H2O 0.55 g/L y cloruro de sodio 4.2 g/L.
Glóbulos rojos de cordero (GRc) en solución Alsever v/v.
Hemolisina. Anticuerpos anti-GRc en TBS. Usar en una dilución que provoque el 50-70% de hemólisis de los GRc sensibilizados (1 UH).
Complemento de cobayo fresco. Suero de cobayo absorbido v/v con GRc al 50% en solución salina.

Desarrollo del proceso

1)Titulación hemolisina

Determinación Unidades Hemolíticas

Lavar GRc 3 veces en TBS. Medir 0.25 mL de sedimento globular y agregar 12.5 mL de TBS (suspensión alrededor del 2%).
Medir 0.5 mL de suspensión alrededor del 2% ,agregar 7.0 mL de agua destilada y determinar densidad óptica (DO) a 550 nm que debe dar una lectura de 0.500.
Si la DO es diferente a 0.500, el volumen final de la suspensión al 2% se calcula de la siguiente manera:
Vf 2% = volumen final al que debe ajustarse.
Vi 2% = volumen inicial de la suspensión alrededor del 2%.
DO = Densidad óptica de la suspensión alrededor del 2% lisada.
Preparar diluciones de 0.2 mL de hemolisina en TBS desde 1/100 a 1/12800 en duplicado.
Añadir 0.2 mL de la suspensión de GRc al 2% a cada dilución.
Incubar por 20 minutos a temperatura ambiente.
Agregar 0.6 mL de complemento de cobayo diluído 1/10 en TBS.
Usar como control un tubo con:
0.2 mL de TBS
0.2 mL de suspensión de GRc al 2%
0.6 mL de complemento de cobayo diluído 1/10.
Incubar 30 minutos en baño de agua a 37ºC.
Centrifugar 1500 rpm (800 x g) por 10 minutos a temperatura ambiente.
Inmediatamente realizar lecturas a ojo desnudo. Una Unidad Hemolítica (1 UH) corresponde a la última dilución donde no se observa sedimento celular después de centrifugar.
Preparar hemolisina "stock" en frascos con 200 Unidades Hemolíticas en solución salina balanceada de Hanks.

Determinación de porcentaje de hemolísis
(1 UH debe corresponder entre 50 a 70% de hemólisis)

Preparar una suspensión de GRc al 2 %.
Diluir hemolisina a 1 UH en TBS.
Poner en una bandeja con hielo una gradilla con tubos. Medir 0.5 mL de suspensión de GRc al 2% y agregar lentamente 0.5 mL de la hemolisina diluída (en duplicado).
Dejar sensibilizar 10 minutos a temperatura ambiente.
Agregar 1.0 mL de complemento de cobayo diluído 1/200 en TBS.
Incubar en baño de agua a 37ºC por 60 minutos ,agitando ocasionalmente.
  Agregar 5.5 mL de TBS y centrifugar a 1500 rpm (800 x g) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Extraer sobrenadante.
  Medir DO a 550 nm.
  En la titulación incluir:
Tubo blanco :sustituir 1.0 mL de complemento de cobayo por 1.0 mL de TBS
Tubo completo :0.5 mL de suspensión de GRc al 2% mas 7.0 mL de agua destilada.
  Calcular el porcentaje de hemólisis.

2) Actividad hemolítica muestra:

Lavar los GRc 3 veces en TBS y suspenderlos aproximadamente al 2% en TBS.
Ajustar espectrofotométricamente la suspensión de GRc al 2%
Medir un volumen (por ejemplo 10 mL) de GRc al 2% y agregar lentamente un volumen igual de hemolisina ajustada a 1 UH.
Incubar la mezcla a 37ºC por 30 minutos (glóbulos rojos sensibilizados). Dejar en hielo hasta su uso.
Diluir suero a titular en TBS. Preparar 2.0 mL de cada una de las diluciones: 1/25, 1/50, 1/75.
En una gradilla sobre hielo colocar una serie de 12 tubos de Kahn más 2 tubos para control positivo y negativo. Añadir:
Tubos test
1
mL
2
mL
3
mL
4
mL
Posit.
mL
Neg.
mL
Sueros problemas 0.50 0.35 0.25 0.15 - -
TBS 0.40 0.55 0.65 0.75 - 0.90
GR sensibilizados 0.60 0.60 0.60 0.60 0.60 0.60
Preparar series idénticas para las diluciones 1/50 y 1/75, incluyendo los tubos controles.
Agitar todos los tubos.
Colocar en baño de agua a 37ºC por 30 minutos. Agitar ocasionalmente.
Añadir 0.5 mL de TBS a 4ºC a todos los tubos, excepto al control (+), que se le añade 1.4 mL de H2O destilada. Agitar suavemente. Centrifugar 5 minutos a 800 x g.
Leer la DO a 550 nm utilizando como blanco el control negativo. Calcular el porcentaje de hemólisis tomando como100% al valor de DO del control positivo.


3) Obtención resultados muestra:

En papel semilogarítmico de probito, graficar los porcentajes de hemólisis (ordenada) versus volumen de suero diluído (abcisa) que se añadió a cada tubo.
Trazar la mejor recta e interpolar para cada dilución del suero problema el volumen que produce el 50% de hemolisis. Este volumen corresponde a una unidad hemolítica (UH) 50%.
Calcular las UH en 1.0 mL y multiplicar por la dilución correspondiente.
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Factor Reumatoídeo
  Introducción

Esta determinación se realiza para identificar factores reumatoídeos, autoanticuerpos de isotipos IgM, IgG e IgA que reaccionan con el fragmento Fc de la IgG en pacientes con artritis reumatoídea. La aglutinación de partículas de látex o de eritrocitos de cordero sensibilizado con anticuerpos (SCAT) detectan preferentemente factor reumatoídeo clase IgM (FR-IgM).

El uso de la prueba SCAT (sheep cells aglutination test) dá un FR positivo en aproximadamente 40 a 70% de los pacientes con artritis reumatoídea. A esta prueba se le atribuye una especificidad mucho más elevada que la aglutinación de partículas de latex.

La determinación del factor reumatoídeo corrientemente utiliza reactivos comerciales basados en la aglutinación de partículas de latex. Estos reactivos contienen partículas de poliestireno de aproximadamente 0.20 a 0.25 µ de diámetro, cubiertas con gamaglobulina humana, suspendidas generalmente en tampón glicina pH 8.2.

La prueba de SCAT se basa en la utilización de eritrocitos de cordero sensibilizados en proporción óptima con anticuerpo anti-eritrocito (hemolisina).


Reactivos y Materiales


1) Técnica aglutinación de partículas de latex. Kit comercial, usar los reactivos indicados por el fabricante.

2) Técnica de SCAT:

Solución Alsever pH 6.1 estéril: Dextosa 20,5 g/L, Citrato de Sodio x 2H2O 8.0 g/L, ácido cítrico x 1 H20 0.55 g/L y cloruro de sodio 4.2 g/L.
Tampón borato-succinato salino pH 7.5.(mezclar volumen a volumen, solución A: ácido succínico 5.9 g/L y solución B: tetraborato de sodio x 10 H2O 19,0 g/L y agregar cloruro de sodio 5.6 g/L.)
Glóbulos rojos de cordero (GRc). Extraer en solución de Alsever y utilizar hasta tres semanas, mantenidos a 4ºC.
Solución salina, cloruro de sodio al 0.9% (SS).
Hemolisina. Anticuerpo de conejo anti-eritrocito de cordero.
Sueros controles positivos, negativos y muestras. Inactivar a 56ºC por 30 minutos (alicuotar en 0.1 mL y mantener a -20ºC hasta su uso).

Desarrollo del proceso

Técnica aglutinación de partículas de latex. Utilizar procedimiento descrito por fabricante.
Técnica SCAT


1) Hemolisina (dilución de trabajo)
Preparar diluciones de la hemolisina desde 1/100 a 1/12800 (8 diluciones en total).
En tubos separados agregar 0.05 mL de cada dilución y agregar 0.05 mL de GRc al 2%.
Agitar e incubar 60 minutos a 37º C.
Leer aglutinación.
La dilución de trabajo de la hemolisina se obtiene multiplicando por 4 la última dilución que presenta aglutinación positiva.

2) Absorción de sueros.
Tubos que contienen 0.1 mL de muestra y controles, añadir 0.6 mL de GRc lavados y resuspendidos al 50% en tampón borato-succinato salino pH 7,5.
Incubar en baño de agua a 37ºC durante 60 minutos y luego a 4ºC por otros 60 minutos.
Centrifugar a 2.000 rpm (1000 x g) por 15 minutos.
Guardar sobrenadante. Se considera diluído 1/4.

3) Sensibilización de GRc.
Ajustar espectrofotométricamente la suspensión de GRc al 2%.
Mezclar volúmenes iguales de GRc al 2% y hemolisina diluída. Incubar a 37ºC durante 60 minutos. Usar inmediatamente.

4) Titulación.
Diluir en forma seriada y en duplicado los sueros problemas desde 1/4 a 1/1024 en placas de aglutinación (0.025 mL por pozo).
Agregar a cada dilución igual volumen de GRc sensibilizado (0.025 mL). Agitar por rotación.
Dejar a 4ºC por 18 horas.
El título corresponde a la última dilución que presenta aglutinación positiva.

5) Controles.
Control de anticuerpos heterófilos.
La dilución 1/8 del suero problema se debe hacer en duplicado para utilizarla como control frente a glóbulos rojos al 2% no sensibilizados.
Control positivo: Suero factor reumatoídeo positivo de título conocido.

Control negativo: Suero factor reumatoídeo negativo.

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Inmunofluoresencia Indirecta
Detección de autoanticuerpos: anticuerpos antinucleares,anti-músculo liso, anti-mitocondrial, otros.

Objetivo

La inmunofluorescencia indirecta permite la detección de autoanticuerpos circulantes contra antígenos tisulares, como anticuerpos antinucleares (AAN), antitiroídeos (AAT), antimitocondriales(AAM), antimúsculo liso (AML), anti-DNA y otros de importancia en enfermedades autoinmunes de relevancia clínica.

La detección de autoanticuerpos se realiza sobre un portaobjeto que lleva el sustrato correspondiente (corte de hígado de rata, sustrato clásico, o células HEp-2 para AAN, corte de riñón de rata para AAM, corte de tiroide humano o de mono para AAT, corte de estómago de rata para AML, Crithidia luciliae para anticuerpos anti-DNA, etc). Los autoanticuerpos específicos del suero del paciente se unen al antígeno presente en el sustrato correspondiente. La unión antígeno-anticuerpo se evidencia con un conjugado anti-inmunoglobulinas humanas-isotiocinato de fluoresceína. La lectura se realiza en un microscopio de fluorescencia con luz incidente (epifluorescencia).

Para los AAN se observan patrones de fluorescencia característicos como homogéneo, moteado, nucleolar, periférico y centromerico que pueden asociarse con algunas especificidades antigénicas(Tabla 1).

TABLA 1.- Patrones de fluorescencia de AAN versus especificidad antigénica.

ANTICUERPOS

ANTÍGENO
PATRÓN FLUORESCENTE
Anti-centrómero Centrómero cromosoma Centromerico en HEp-2, puede ser negativo en tejido.
Anti-DNA DNA doble hebra Periférico u homogéneo, típico pero cualquier es posible.
Anti-Histona Proteínas básicas unidas a DNA Homogéneo o periférico.
Anti-Jo-1 Proteína, histidina tRNA sintetasa Moteado o no se detecta
Anti-Nucleolar Antígenos nucleolares Nucleolar
Anti-PCNA Antígenos nucleares de células en proliferación PCNA en HEp-2, no se detecta en tejido
Anti-RNP (nRNP, U1 RNP) Proteína acídica, U1 ribonucleoproteína (extractable) Moteado
Anti-Sm Nucleoproteína acídica (extractable) Moteado
Anti-Scl-70 Proteína no histona básica, DNA topoisomerasa Moteado o no detectado
Anti-huso Huso en células en división Huso en HEp-2, no detectado en tejido
Anti-SSA (Ro) Proteína acídica Moteado frecuentemente en HEp-2, no detectado en tejido
Anti-SSB ( La) Proteína acídica (extractable) Moteado


Reactivos y Materiales

Tampón fosfato salino (PBS) 0.01 M;pH 7.2.NaCl 0.15M
Conjugado anti-inmunoglobulinas humana-isotiocianato de fluoresceína. (relación molar fluoresceína/proteína, F/P 2 a 3).
Para AAN: sustrato de hígado de rata 1 a 2 m de grosor o células HEp-2
Sueros controles positivo y negativo.
Líquido de montaje: cloruro de sodio 0.15 M y trizma base al 2 % p/v en glicerina.


Desarrollo del proceso


Para determinación de AAN: en cortes de tejido, diluir muestra 1/20 y 1/80 en PBS y en células HEp-2, 1/40 y 1/160 en PBS. Aplicar control positivo, control negativo y PBS.
Incubar en cámara húmeda y oscura a 37ºC por 30 minutos.
Lavar cada lámina con PBS a temperarura ambiente por 10 minutos por dos veces.
Aplicar el conjugado en la dilución de trabajo en PBS.
Incubar en cámara húmeda a temperatura ambiente por 30 minutos.
Lavar dos veces con PBS durante 10 minutos.
Añadir una gota de líquido de montaje y colocar cubreobjeto, sin dejar burbujas.
Leer en microscopio de epifluorescencia en campo oscuro. Las muestras positivas se someten a titulación.
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Enzimainmunoanálisis (EIA)
Determinación de autoanticuerpos (anti-ENA, anti-proteinasa-3, anti-mieloperoxidasa, anti-DNA, anti-cardiolipina, etc.), marcadores tumorales, IgE total y otras.

Objetivo


El enzimainmunoanálisis (EIA) es una metodología que permite cuantificar anticuerpos o antígenos en muy baja concentración (menos de 1 ng/ml) en la mayoría de los líquidos biológicos y sobrenadantes de cultivos celulares. Se ha usado ampliamente en el estudio de la respuesta de anticuerpos frente antígenos complejos. En el laboratorio de inmunología se utiliza corrientemente para detectar y cuantificar autoanticuerpos y diversas proteínas e inmunoglobulinas en baja concentración en los líquidos biológicos.

De acuerdo a lo anterior el EIA puede aplicarse a una amplia gama de situaciones, entre las que destacan las siguientes:

Apoyo diagnóstico a enfermedades autoinmunes
Diagnóstico de enfermedades infecciosas.
Diagnóstico de enfermedades alérgicas
Estudio de marcadores tumorales
Cuantificación de proteínas circulantes en baja concentración
Niveles plasmáticos de drogas y hormonas.

El enzimainmunoanálisis se basa en dos fenómenos biológicos: la alta especificidad del anticuerpo por su antígeno y la amplificación de la unión antígeno-anticuerpo por reacciones químicas llevadas a cabo por enzimas. Por tanto, esta metodología consiste en una reacción inmunológica y una indicadora enzimática. El EIA en fase líquida sin etapas de separación, se conoce como sistema homogéneo, ejemplo, el EMIT (enzyme-multiplied immunoassay technique). El EIA en fase sólida requiere etapas de separación y recibe el nombre de sistema heterogéneo, ejemplos, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), MEIA (EIA en micropartículas).

Reactivos y Materiales
En este texto se indican los reactivos generales a utilizar en un ELISA.

Tampón de recubrimiento (coating). Carbonato 0.05 M;pH 9.6
PBS - BSA 1 %.
Tampón sustrato para fosfatasa alcalina :Dietanolamina 10%; pH 9.8.
Sustrato para fosfatasa alcalina: p-nitrofenilfosfato (1 mg/mL).
Tampón sustrato para peroxidasa: tampón citrato-fosfato pH 5.0: ácido cítrico x 1 H2O 21.0 g/L y fosfato disódico 28.4 g/L.
Sustrato para peroxidasa: ortofenilendiamina al 0,04%.

Ortofenilendiamina
40,0 mg
Agua Oxigenada 30% 40,0 uL
Tampón Citrato-fosfato c.s.p. 100,0 mL

Conjugado-fosfatasa alcalina o Conjugado-peroxidasa (anti-inmunoglobulinas u otro.). Usar según dilución de trabajo (1/500 a 1/1500 o más).
Solución de detención:

Fosfatasa Alcalina
NaOH 3.0 M.
Peroxidasa H2SO4 2.5 M


Desarrollo del proceso
*Para reactivos comerciales seguir indicaciones fabricantes
*Para técnica del laboratorio, seguir los siguientes pasos:

Cubrir los pocillos de las placas con antígeno o anticuerpo, según sea el caso, en una concentración de 0.01 a 1 ug/ 0.1 mL/pozo en tampón de recubrimiento.
Dejar 1 hora a 37ºC y luego toda la noche a 4ºC.
Lavar 6 veces (3 minutos por vez) con PBS y dejar 1 hora con PBS- BSA 1% a temperatura ambiente
Agregar 0.1 mL en cada pozo del anticuerpo o antígeno control, según sea el caso, en diferentes concentraciones (5 diluciones) y las muestras a estudiar diluídas en PBS - BSA 1%
Incubar por 1 hora a 37ºC.
Lavar seis veces con PBS.
Agregar 0.1 mL en cada pozo del conjugado correspondiente diluído en PBS – BSA 1%.
Incubar por 1 hora a 37ºC o dejar toda la noche 4ºC.
Lavar seis veces con PBS
Agregar 0.1 mL en cada pozo de la solución sustrato correspondiente.
Dejar por 15 a 30 minutos a temperatura ambiente en oscuridad.
Detener la reacción con 0.05 mL de NaOH 3 M o H2SO4 2.5 M, según corresponda.
Leer a 405 nm para fosfatasa alcalina o 492 nm para peroxidasa.
Graficar en papel log-log la densidad óptica versus concentración del anticuerpo o antígeno control e interpolar las lecturas de las muestras.

 

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Referencias
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Chau-Ching L. et al. A semi-automated microassay for complement activity. J. Immunol Method. 1988; 114: 33.
Grabar P. and Burton P. Immunoelectrophoresis. Toray S.A. Barcelona 1968.
Harlow E. and Lane D. Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 1988.
Keren D.F., Alexanian R., Goeken J. A., Gorevic P.D., Kyle R.A. and Tomar R.H. Guidelines for clinical and laboratory evaluation of patients with monoclonal gammopathies. Arch. Pathol. Lab. Med. 1999; 123: 106-107.
Kern P., Kron M. and Hiesche K. Measurement of antinuclear antibodies: assessment of different test systems. Clin. Diag. Lab. Immunol. 2000; 7 (1): 72-78.
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